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核酸的定量是双光束紫外分光光度计使用频率较高的功能
  • 发布日期：2017-07-05      浏览次数：1932
      •     核酸的定量是双光束紫外分光光度计使用频率较高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波长260nm。每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输进原液和稀释液的体积，尔后测试空缺液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者头痛的题目。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。 
          事实上，双光束紫外分光光度计的设计原理和工作原理，答应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的正确度和度。如EppendorfBiophotometer的正确度≤1.0%（1A）。这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动，都是正常的。另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液，如TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值好在0.1-1.。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过双光束紫外分光光度计的测试范围）。后是操纵因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空缺液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空缺液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的小体积等多个操纵事项。
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